Nel 1995, a soli sedici anni diventa campione italiano della classe 125, l'anno successivo esordisce nel campionato del mondo (sempre nella 125), ed ottiene la sua prima vittoria nel Gran Premio della Repubblica Ceca a Brno, dopo aver conquistato anche la sua prima pole position. Nel 1997 sempre nella 125, ottiene il suo primo titolo mondiale, correndo con l'Aprilia.
L'anno seguente, sempre su Aprilia, passa alla classe 250. Dopo un primo anno di ambientamento, nel 1999 ottiene anche in questa classe il titolo iridato.
Il 2000 è l'anno del passaggio alla classe regina, la classe 500, e del cambio di moto. Firma, infatti, un contratto con la Honda. Anche nella 500 il primo anno è di studio, ma nel 2001, ultima stagione prima della sostituzione di questa classe con la MotoGP, arriva il terzo titolo iridato. Sempre nel 2001, Rossi si cimenta nella prova più importante del Mondiale Endurance per le case giapponesi: la 8 ore di Suzuka, imponendosi assieme all'allora compagno di marca (e ufficiale SuperbikeHonda) Colin Edwards.
L'introduzione della nuova classe, nella quale tutti i piloti sono "esordienti", non costituisce problemi per Valentino, che riesce a imporsi fin dalla prima edizione (2002) e a bissare il titolo iridato l'anno successivo (2003).
Nella stagione 2004 Rossi passa alla Yamaha; inizialmente la mossa solleva qualche perplessità perché la nuova marca è giudicata tecnicamente inferiore alla Honda, nell'arco della stagione precedente ha infatti ottenuto solo un terzo posto. Valentino raccoglie comunque la sfida e porta nel nuovo team, oltre al suo talento, alcuni elementi chiave della sua vecchia squadra, come per esempio l'esperto capotecnico australiano e suo grande amico Jeremy Burgess. Il risultato è una moto nettamente migliorata, anche se ancora inferiore alla Honda, che Valentino riesce però a portare alla vittoria nel motomondiale 2004, a dodici anni di distanza dall'ultimo titolo di un pilota Yamaha, l'americano Wayne Rainey.
La stagione 2005 vede Valentino andare ancora contro tutti i pronostici, favorevoli alla Honda, dominando l'inizio della stagione. Si laurea campione del mondo con quattro gare di anticipo a Sepang, Malesia, il 25 settembre.
Il 2 agosto dello stesso anno, Rossi firma un rinnovo annuale con la Yamaha anche per la stagione 2006, rifiutando una lauta offerta della Ducati e una potenziale ipotesi di esordire in Formula 1 con la Scuderia Ferrari.
La stagione 2006 è stata probabilmente l'unica in cui il pilota pesarese è sembrato in seria difficoltà: ad un generale calo di prestazioni (chiuderà la stagione con 5 vittorie, 6 in meno dell'anno precedente) e due cadute (Assen e Valencia), si sommeranno anche episodi di sfortuna, come due rotture del motore (Le Mans e Laguna Seca). Nonostante la stagione non avesse un vero leader di classifica, Valentino a 5 gare dal termine si trova a ben 51 punti di distanza dalla testa. A questo punto ha avuto inizio la sua rimonta: grazie ad una vittoria e tre podi, e favorito anche da un calo di prestazioni del suo diretto rivale Nicky Hayden (da ricordare la caduta di Pedrosa all'Estoril che lo ha trascinato fuori pista), il pesarese riesce addirittura a ribaltare la situazione. All'ultima gara della stagione Valentino si trova infatti primo in classifica, con 8 lunghezze di margine. Quando ormai tutti i suoi tifosi, ed in generale tutti gli appassionati di motociclismo, vedevano ripetersi il copione degli anni precedenti, avviene il colpo di scena: dopo una brutta partenza dalla Pole Position, Valentino cade nel tentativo di rimontare gli avversari. A nulla servirà il suo tentativo di rientrare in gara (chiuderà al 13° posto): il suo rivale Nicky Hayden, grazie ad un terzo posto, riuscirà a balzare nuovamente in testa alla classifica diventando campione iridato e rompendo l'imbattibilità di Rossi dei 4 anni precedenti.